酶聯免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以簡單地測出樣本中有多少蛋白質、多肽、抗體，是實驗室比較常用的一種檢測方法。而這種簡單的分析方法的核心，就是標準曲線。沒有它，我們的實驗就變成了一個二元的“是/不是”測試。有了它，我們可以深入研究生物反應的細節。

有多少人對ELISA標準曲線擬合頭痛？！今天將以二次曲線回歸為例，講解如何使用ELISAcalc軟件繪制標準曲線，具體實驗請選擇合適的擬合方式（以回歸系數最接近1.0為準）

Step1：打開軟件ELISACalc，界面如下：
（點擊下載軟件 ELISACalc.zip）

Step2：輸入數據：

① 標準品有S1 , S2 , S3 , S4 , S5 , S6 , S7 ,7個濃度。（0孔也就是Blank值不用輸入）

②“X”代表濃度/劑量，“Y”代表OD/反應值。在運行軟件的X、Y列中，依次輸入相對應的值，如下圖所示：

Step3：回歸/擬合 模型（M），下拉選擇二次曲線回歸，X數據列下拉選擇對數（10為底），Y數據列下拉選擇對數（10為底），如下圖所示：

Step4：點擊“回歸/擬合”，顯示標曲。

Step5：點擊“回歸方程”，可以得到二次曲線回歸方程以及r2值等。（同一個試劑盒可以用多種方式進行擬合，例如：四參數、直線。最終根據r2值大小判斷曲線的擬合程度，越接近1，擬合程度越好。）

Step6：標準曲線已知，并且“X”濃度/劑量 和“Y”OD/反應值是已知的。根據標準曲線求濃度，也就是“由Y計算X”，來計算樣本濃度。在空格中輸入樣品的OD值，回車或點擊“計算"，即能計算對應的濃度。（點擊“復制”按鈕可以將結果全部復制下來，粘貼到EXCEL表格中進行下一步做圖分析。）

1、二次曲線計算的結果會有兩個解，要舍掉其中一個偏離度大的。

2、Log-logit的擬合方法是用于競爭法的，競爭法也可以用四參數或五參數的方式進行擬合。

3、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結果無從談起。

4、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內，包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內。

5、最好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，ELISA試劑盒這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。

6、檢測標準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。

7、標準曲線的樣品數一般為7個點，但至少要保證有5個點。

8、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一般來說，相關系數R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999。

要想繪制出合格的標準曲線、使用好標準曲線，真心不易，必須將各個方面的條件都考慮進去，即對標準曲線的繪制也實行質量控制，只有這樣, 才能得出理想的標準曲線。

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